• partner portalu
  • partner portalu
  • partner portalu
Partnerzy portalu

Porównanie metod identyfikacji bakterii lactobacillus

Bakterie kwasu mlekowego są grupą drobnoustrojów o bardzo dużym znaczeniu ekonomicznym z uwagi na ich szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym (kultury starterowe i kultury ochronne) oraz w medycynie i biotechnologii (probiotyki). Zastosowanie odpowiednich technik umożliwiających precyzyjne, szybkie i jednocześnie wydajne ekonomicznie analizy jest bardzo ważne i stanowi często istotę zróżnicowania bakterii i w dużej mierze decyduje o uzyskanym wyniku.
  • Autor: Joanna Bucka-Kolendo, Barbara Sokołowska, ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2021, 28, 2 (127)
  • Data: 29-10-2021, 13:31
Porównanie metod identyfikacji bakterii lactobacillus
Identyfikacja bakterii lactobacillus; fot. shutterstock.com

Najczęściej stosowanymi metodami identyfikacji gatunków LAB są metody bazujące na genomice (16S,pheS, RAPD, rep-PCR, MLST, Real Time-PCR, DGGE/TGGE) i proteomice (MALDI-TOF MS, 2-DE) [1, 2, 3, 7, 11, 13, 14]. Dokonując wyboru techniki identyfikacji LAB, należy mieć na uwadze trzy kryteria: metoda musi charakteryzować się wystarczająco czułym potencjałem różnicującym, powtarzalnością oraz typowalnością, czyli możliwością zidentyfikowania na poziomie rodzaju, gatunku, a nawet szczepu. Powinna być również szybka i ekonomicznie opłacalna [14].

Przy wyborze metod związanych z genami konserwatywnymi trzeba uwzględniać takie czynniki, jak długość analizowanego odcinka genu oraz siła dyskryminująca genu, jak również to, że różne geny mogą dostarczać innych wyników filogenetycznych przypisujących szczepy do innego sąsiedztwa. Przez wiele lat analiza sekwencji genu 16S rDNA była referencyjnym wyznacznikiem w określaniu filogenetycznego pokrewieństwa bakterii LAB. Stwierdzono jednak, że w przypadku blisko spokrewnionych gatunków LAB metoda ta ma zbyt małą rozdzielczość, a gen kodujący podjednostkę 16S rRNA może wykazywać niewielki stopień polimorfizmu.

Ponadto wysoki stopień zróżnicowania fenotypowego i genotypowego oraz zawartość par zasad G+C w zakresie 32 ÷ 54 % może nastręczać problemów w ich identyfikacji [8]. Z tego powodu poszukiwano innych genów konserwatywnych, które mogłyby posłużyć jako wiarygodne narzędzie różnicujące o dużej czułości. Taki gen powinien charakteryzować się powszechnością występowania w genomie bakteryjnym i powinien zawierać w sobie swoisty, zmienny region, który pozwoli na jednoznaczne zróżnicowanie gatunków/podgatunków [12]. Jedną z alternatyw sekwencjonowania genu 16S jest analiza genu pheS, kodującego podjednostkę α-syntazy fenyloalanylo-tRNA (Phe-tRNA). Analiza sekwencji genu pheS uznawana jest za wiarygodną metodę dyskryminującą [4, 8, 10] i jest obecnie powszechnie stosowanym narzędziem do identyfikacji bakterii LAB.

Pomimo dużych możliwości analizy genów konserwatywnych taksonomia tego rodzaju nie daje odpowiedzi na pytania dotyczące korelacji filogenetyki z właściwościami fizjologicznymi lub ekotypem [5]. Wprowadzane są dodatkowe techniki chemotaksonomiczne, jak MALDI-TOF MS (ang. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry), analizujące białka rybosomalne.

W ostatnich latach nastąpił rozwój identyfikacji mikroorganizmów techniką MALDI-TOF MS, głównie pochodzenia klinicznego, ale również występujących w sektorze spożywczym. Metoda polegająca na analizie „odcisku palca” białek rybosomalnych, charakterystycznych dla danej rodziny, rodzaju, gatunku, a nawet dla poszczególnych szczepów, umożliwia identyfikację profili widm masowych badanych szczepów poprzez porównanie ich z biblioteką zawierającą referencyjne widma odniesienia.
W odróżnieniu od technik genomowych, w których analizowane sekwencje są przyrównywane w ciągle rozbudowywanej i aktualizowanej, światowej bazie danych NCBI BLAST (ang. Basic Local Alignment Search Tool), w technice MALDI-TOF MS identyfikacja mikroorganizmów odbywa się przy użyciu wewnętrznych baz przynależnych do danego urządzenia i ewentualnie rozbudowywanych o nowe profile widm masowych na potrzeby danego laboratorium. Ograniczenia w identyfikacji MALDI-TOF
MS blisko spokrewnionych gatunków, jak w przypadku LAB, mogą wynikać z braku referencyjnych widm masowych w bazie danych przynależnej do aparatu, z błędów technicznych powstałych podczas przygotowania próbki do analizy lub z różnych warunków hodowlanych, które mogą oddziaływać na wynik analizy [1].Takie ograniczenia mogą stanowić dużą przeszkodę we właściwej identyfikacji mikroorganizmów, szczególnie nowych, niewystępujących w danej bazie danych.

Celem pracy była ocena możliwości różnicowania 12 szczepów Lactobacillus przy użyciu metod powszechnie stosowanych w laboratoriach: sekwencjonowania genu 16S rDNA, genu pheS oraz MALDI-TOF MS.

Materiał i metody badań

Badaniom poddano 12 szczepów Lactobacillus wyizolowanych z żywności, w tym jeden szczep pochodzący z kolekcji DSMZ – tab. 1. Zgodnie z nową nomenklaturą [15] bakterie kwasu mlekowego zreklasyfikowano na podstawie najnowszych danych genetycznych i filogenetycznych.

Bakterie kwasu mlekowego izolowano z produktów spożywczych zgodnie z pro- cedurą PN-ISO 15214:2002 [9]. W zależności od potrzeb LAB posiewano na pożywkę MRS agar (Lactobacillus Agar według DeMan, Rogosa i Sharpe, Merck KGaA, Niem- cy) lub do pożywki MRS bulion (Merck KGaA, Niemcy) i inkubowano w temp. 30 ºC przez 72 h w warunkach anaerobowych.

Zastosowano trzy rodzaje analiz (sekwencjonowanie genu 16S, pheS oraz MALDI-TOF MS) w celu porównania możliwości różnicujących każdej z metod. Do izolacji DNA z 18-godzinnych hodowli płynnych badanych szczepów używano zestawu ExtractMe DNA Bacteria Kit (Blirt, Gdańsk, Polska) zgodnie z instrukcją producenta. Sekwencjonowanie genu 16S rDNA prowadzono z wykorzystaniem primerów 16SF: 5′-AGACTTTGATCCTGGCTCAG-3′ i 16SR: 5′-ACGGCTACCTTG TTACGACT-3′ amplifikujących prawie całą sekwencję genu o długości ok. 1500 bp. Warunki przeprowadzonej reakcji opisano w pracy Buckiej-Kolendo i wsp. [3]. Analizę genu pheS prowadzono z wykorzystaniem primerów pheS-21-F: 5’-CAYCCNGCHCGYGAYATGC-3’ i pheS-22-R: 5’ GGRTGRACCATVCCNGCHCC -3’ w warunkach podanych przez Nasera i wsp. [7]. Na podstawie wyników sekwencjonowania genu 16S rDNA i pheS badanych szczepów Lactobacillus przeprowadzano analizę filogenetyczną z zastosowaniem algorytmu CLUSTAL W. Przy użyciu programu MEGAX [6] dokonywano alignmentu sekwencji i konstruowano na ich podstawie drzewa z wykorzystaniem analizy NeighborJoining z odległościami obliczonymi metodą największej wiarygodności. Odległości ewolucyjne obliczano przy użyciu metody największej złożonej wiarygodności.

Zostały one podane w jednostkach liczby podstawień zasad przypadających na miejsce. Ostateczny zbiór danych zawierał łącznie 1480 pozycji dla genu 16S DNA oraz 390 pozycji dla pheS. Różnorodność nukleotydów badanych sekwencji była odpowiednio na poziomie π = 0,86 i 0,16.  Analizę MALDI-TOF MS wykonywano przy użyciu dwóch niezależnych aparatów Biotyper (Bruker Daltonik GmbH, Niemcy), każdy z własną bazą danych. Do badań stosowano 18-godzinne hodowle LAB w warunkach przedstawionych przez Bucką-Kolendo i wsp. [3]. W obu przypadkach jako matrycę stosowano HCCA (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid). Analizę widm masowych przeprowadzona w programie BioNumerics 7.6.3 (Applied Maths). Wykonano po trzy powtórzenia widm wszystkich badanych szczepów.

Hierarchiczną analizę skupień widm MALDI-TOF MS prowadzono na podstawie macierzy podobieństw obliczonej z zastosowaniem współczynnika Pearsona. Profile widm masowych tworzono w odniesieniu do ich sygnałów i intensywności otrzymanych pików. Alignment i grupowanie prowadzono z tolerancją liniową 300 ppm i stałą tolerancją 0,5. Wyniki uzyskane techniką MALDI-TOF MS poddano analizie wielowymiarowego skalowania profili widm masowych (MDS – Multi Dimensional Scaling), która jest uważana za alternatywę analizy czynnikowej.

Wyniki i dyskusja

Na podstawie badań filogenetycznych, mających na celu ustalenie wzajemnego pokrewieństwa szczepów Lactobacillus, przeprowadzonych metodą analizy sekwencji genów 16S i pheS, wykazano, że gen 16S miał większy potencjał różnicujący. Podobieństwo analizowanych sekwencji genu 16S rDNA (rys. 1) było na poziomie 89 % dla 10 szczepów, homologia 2 szczepów (L. backii 103 i L. brevis 557) stanowiła mniej niż 79 % w stosunku do pozostałych i zostały one ujęte w oddzielny klaster. Otrzymana różnorodność nukleotydowa sekwencji była na poziomie π = 0,86. Wyniki nie korelowały z wynikami identyfikacji bakterii bazującej na sekwencjonowaniu genu 16S
rDNA.

Drzewo filogenetyczne sekwencji genu pheS (rys. 2) podzielono na dwa klastry. Jeden klaster zawierał 8 szczepów z homologią na poziomie 90 ÷ 98 %, a drugi – z 2 szczepami: 557 i 432, których podobieństwo wynosiło poniżej 90 %. W przypadku 2 szczepów: 102 i 103 nie udało się otrzymać sekwencji genu pheS. Różnorodność nu- kleotydowa π była na poziomie 0,16. Uzyskane wyniki korelują z wynikami identyfikacji bakterii na podstawie sekwencji genu pheS, w której 8 szczepów (DSM 6235, 1178, 975, 863, 738, 489, 133, 3/16/1) scharakteryzowano jako L. plantarum, a 2 szczepy (557 i 432) – jako L. brevis.

W celach porównawczych stopnia identyfikacji techniką MALDI-TOF MS z analizą sekwencji 16S rDNA i genu pheS wykonano dendrogram profili widm masowych (rys. 3). Analizę przeprowadzono metodą UPGMA. W analizie profili widm masowych (MSP) względną odległość między odkształceniami przedstawia się w jednostkach arbitralnych, gdzie 100 oznacza całkowite podobieństwo, a 0 oznacza minimalne podobieństwo.

W wyniku rozmieszczenia badanych szczepów jako punktów w przestrzeni n-wymiarowej zaobserwowano rozłożenie podobieństw i różnic pomiędzy badanymi szczepami LAB (rys. 4). Rozłożenie korelowało z hierarchiczną analizą skupień widm masowych.

W analizie klastrów zidentyfikowanych na podstawie sekwencji genów 16S rDNA i pheS zaobserwowano, że gen pheS w badanych szczepach charakteryzował się wysokim stopniem konserwatywności i niskim potencjałem różnicującym. Analizą sekwencji pheS dowiedziono, że bakterie z rodzaju Lactobacillus mają duże pokre- wieństwo tego genu, co może wskazywać na niewielkie możliwości jego zastosowania jako wiarygodnego i czułego narzędzia do różnicowania. Tylko w przypadku 3 szcze- pów w obu metodach uzyskano ten sam wynik identyfikacji (L. plantarum 1178, L. plantarum 867 i L. brevis 557). Spośród metod molekularnych analiza genu 16S rDNA umożliwiła uwidocznienie większej różnorodności badanych szczepów w porównaniu z analizą pheS (tab. 2), co potwierdzono również w analizie różnorodności nukleotydowej badanych sekwencji, w której współczynnik π był wyższy dla genu 16S rDNA (0,86) niż dla genu pheS (0,16). Po przeprowadzeniu analizy 16S r DNA zidentyfikowano 4 szczepy L. brevis (DSM 6235, 557, 489, 3/16/1), po 2 szczepy L. plantarum (1178, 863), L. rhamnosus (975, 115), L. backii (102, 103) i po jednym – L. curvatus (432) i L. rossiae (738). W analizie genu pheS zróżnicowanie szczepów było znacznie mniejsze. Otrzymano 8 szczepów L. plantarum (DSM 6235, 1178, 975, 863, 738, 489,
133, 3/16/1) i 2 szczepy L. brevis (557, 432). W przypadku 2 szczepów scharakteryzowanych jako L. backii, w analizie 16S rDNA nie udało się uzyskać sekwencji pheS. Stwierdzono, że badaniem sekwencji 16S rDNA uzyskuje się większe możliwości różnicujące.

W identyfikacji metodą MALDI-TOF MS, w obu analizach, uzyskano taki sam  wynik dla 10 z 12 szczepów: 7 – L. brevis (DSM 6235, 102, 103, 489, 863, 975, 3/16/1), 2 – L. plantarum (1178, 133) i 1 – L. curvatus. W przypadku szczepów 432 i 738 otrzymano różną identyfikację. Identyfikacja wybranych bakterii kwasu mlekowego metodami molekularnymi i porównanie ich z metodą MALDI-TOF MS doprowadziły do wniosku, że wyniki wszystkich metod pokrywały się tylko w przypadku jednego szczepu L. plantarum 1178. Dla porównania taką samą identyfikację z użyciem genu 16S rDNA i MALDI-TOF MS uzyskano dla 5 szczepów, w tym 3 szczepów L. brevis (DSM 6235, 3/16/1 i 489), jednego szczepu L. plantarum 1178 i szczepu F. rossiae 738, ale w przypadku MALDI-TOF MS tylko z pierwszej analizy. W wyniku porównania metod z wykorzystaniem sekwencjonowania genu pheS i MALDI-TOF MS uzyskano taki sam wynik (w obu metodach) w przypadku szczepów 1178 i 133 i zidentyfikowano je jako L. plantarum, a w przypadku pierwszej analizy MALDI-TOF MS scharakteryzowano szczep 432 jako L. brevis.

Jak podają Naser i wsp. [8], analiza różnicowania blisko spokrewnionych bakterii z rodzaju Lactobacillus na podstawie genu pheS stanowi wiarygodną, alternatywną metodę dla genu 16S rDNA. W badaniach własnych wykazano jednak, że identyfikacja szczepów LAB z zastosowaniem sekwencjonowania genu pheS była mało zróżnicowana, a w analizie porównawczej odnotowano wysoki poziom homologii tego genu w badanych szczepach (98 %). Podobne wyniki uzyskali wcześniej Naser i wsp. [7] w badaniach nad identyfikacją bakterii z gatunku Enterococcus. Zaobserwowali oni, że gen pheS miał wysoki stopień homogeniczności wśród badanych szczepów. Podobieństwo sekwencji genu pheS w szczepach Enterococcus wynosiło 97 %, co wskazywało na niską moc dyskryminacyjną tego genu przy zastosowaniu do różnicowania wewnątrzgatunkowego. Sanches-Juanes i wsp. [10] stwierdzili, że identyfikacja bakterii kwasu mlekowego z użyciem genu pheS oraz metoda MALDI-TOF MS są wiarygodnymi technikami identyfikacji tych bakterii i mają dużą siłę dyskryminacyjną.

Obie techniki umożliwiły autorom przypisanie bakterii do właściwego rodzaju i gatunku. W przypadku badań własnych takie same wyniki otrzymano dla dwóch z 12 szczepów zidentyfikowanych jako L. plantarum (1178, 133), z czego tylko jeden szczep 1178 został potwierdzony jako L. plantarum również w analizie 16S rDNA oraz dla szczepu 432 w jednej analizie MALDI-TOF MS, w której został on przypisany do L. brevis. W identyfikacji bakterii metodą MALDI-TOF MS kluczowa jest zasobność bazy danych urządzenia w widma masowe, gdyż w dużej mierze od niej zależy właściwe scharakteryzowanie mikroorganizmu.

Porównanie wyników identyfikacji przy użyciu dwóch urządzeń, ale zawierających różne biblioteki danych, dowodzi, że w niektórych przypadkach identyfikacja może się różnić (szczep 432, 738).

Wnioski

  1. Przy doborze metod różnicujących i identyfikujących szczepy bakterii kwasu mlekowego stwierdzono, że sekwencjonowanie genu 16S rDNA umożliwiło większe zróżnicowanie bakterii w porównaniu z analizą genu pheS, który charakteryzował się większą homologią, a przez to miał znacznie mniejszy potencjał różnicujący.
  2. Wartość współczynnika różnorodności nukleotydowej (π) sekwencji potwierdziła większą homologię w obrębie genu pheS w stosunku do genu 16S rDNA.
  3. Analizą nukleotydową badanych sekwencji nie wykazano korelacji z analizami filogenetycznymi.
  4. Stwierdzono, że możliwości dyskryminacyjne MALDI-TOF MS są porównywalne do innych stosowanych procedur identyfikacyjnych. Metoda ta nadaje się do rutynowego stosowania dzięki szybkości, precyzji i prostocie przygotowania próbki.
  5. Uznano, że przy identyfikacji bakterii metodą MALDI-TOF MS duże znaczenie miała biblioteka referencyjnych widm masowych, do której analizowane szczepy były porównywane.

 

Literatura

[1] Akimowicz M., Bucka-Kolendo J.: MALDI-TOF MS – application in food microbiology. Acta Biochimica Polonica, 2020, (3) 67, 327-332.

[2] Berg G., Rybakova D., Fischer D., Cernava T., Verges M.-C.C., Charles T., Chen X., Cocolin L., Eversole K., Corral G.H., Kazou M., Kinkel L., Lange L., Lima N., Loy A., Macklin J.A., Maguin  E., Mauchline T., McClure R., Mitter B., Rayan M., Sarand I., Smidt H., Schelkle B., Roume H., Kira G.S., Selvin J., de Souza R.S.C., van Overbeek L., Singh B.K., Wagner M., Walsh M., Sessitsch A., Schloter M.: Microbiome definition re-visited: Old concepts and new challenges. Microbiome, 2020, 8, #103.

[3] Bucka-Kolendo J., Sokołowska B., Winiarczyk S.: Influence of high hydrostatic pressure on the  identification of Lactobacillus by MALDI-TOF MS – Preliminary study. Microorganisms, 2020, 8 (6), #813.

[4] Chao S.-H., Kudo Y., Tsai Y.-Ch., Watanabe K.: Lactobacillus futsaii sp. nov., isolated from futsai  and suan-tsai, traditional Taiwanese fermented mustard products. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2012,
62 (3), 489-494.

[5] Foschi C., Laghi L., Parolin C., Giordani B., Compri M., Cevenini R., Margangoni A., Vitali B.:
Novel approaches for the taxonomic and metabolic characterization of lactobacilli: Integration of 16S rRNA gene sequencing with MALDI-TOF MS and H-NMR. PLoS ONE, 2017, 12(2), #e0172483.

[6] Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K.: MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Mol. Biol. Evol., 2018, 35, 1547-1549.

[7] Naser S., Thompson F., Hoste B., Gevers D., Dawyndt P., Vancanneyt M., Swings J.: Application of
multilocus sequences analysis (MLSA) for rapid identification of Enterococcus species based on rpoA and pheS genes. Microbiology, 2005, 151, 2141-2150. Naser S., Dawyndt P., Hoste B., Gevers D., Vandemeulebroecke K., Cleenwerck I., Vancanneyt M., Swings J.: Identification of lactobacilli by pheSand rpoA gene sequence analyses. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2007, 57, 2777-2789.

[9] PN-ISO 15214:2002. Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby mezofilnych bakterii fermentacji mlekowej. Metoda płytkowa w temperaturze 30 stopni C.

[10] Sánchez-Juanes F., Teixeira-Martín V., González-Buitrago J.M., Velázquez E., Flores-Félix J.D.: Identification of species and subspecies of lactic acid bacteria present in Spanish cheeses type “Torta” by MALDI-TOF MS and pheS gene analyses. Microorganisms, 2020, 8(2), #301.

[11] Sharma A., Lee S., Park Y.-S.: Molecular typing tools for identification and characterizing lactic
acid bacteria: A review. Food Sci. Biotechnol., 2020, 29(10), 1301-1318.

[12] Stackebrandt E., Fredriksen W., Garrity G.M., Grimont P.A.D., Kampfer P., Maidem M.C.J., Nesme X., Rossello-Mora R., Swings J., Truper H.G., Vauterin L., Ward A.C., Whitman W.B.: Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52, 1043-1047.

[13] Stefańska I., Stecka K.: Postępy w identyfikacji i różnicowaniu bakterii fermentacji mlekowej. Część I. Postępy Nauki i Technologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, 2012, 67 (3), 35-51.

[14] Stefańska I., Stecka K.: Postępy w identyfikacji i różnicowaniu bakterii fermentacji mlekowej.
Część II. Postępy Nauki i Technologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, 2012, 67 (4), 49-66.

[15] Zheng J., Wittouck S., Salvetti E., Franz C.M.A.P., Harris H.M.B., Mattarelli P., O’Tolle P.W., Pot
W., Vandamme P., Walter J., Watanabe K., Wuyts S., Felis G.E., Ganzle M.G., Lebeer S.: A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description on 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. Int. J.
Syst. Evol. Microbiol., 2020, 70, 2782-2858.

Artykuł pochodzi z czasopisma ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2021, 28, 2 (127)

Powiązane tematy:

Partnerzy serwisu
  • partner serwisu
  • partner serwisu
subskrybuj portalspozywczy.pl

Portal Spożywczy: polub nas na Facebooku



Obserwuj Portal Spożywczy na Twitterze


NEWSLETTER

Zamów newsletter z najciekawszymi i najlepszymi tekstami naszego portalu.

Dodając komentarz, oświadczasz, że akceptujesz regulamin forum

NEWSLETTER

Bądź na bieżąco!

Drogi Użytkowniku!

W związku z odwiedzaniem naszych serwisów internetowych możemy przetwarzać Twój adres IP, pliki cookies i podobne dane nt. aktywności lub urządzeń użytkownika. Jeżeli dane te pozwalają zidentyfikować Twoją tożsamość, wówczas będą traktowane dodatkowo jako dane osobowe zgodnie z Rozporządzeniem Parlamentu Europejskiego i Rady 2016/679 (RODO).

Administratora tych danych, cele i podstawy przetwarzania oraz inne informacje wymagane przez RODO znajdziesz w Polityce Prywatności pod tym linkiem.

Jeżeli korzystasz także z innych usług dostępnych za pośrednictwem naszych serwisów, przetwarzamy też Twoje dane osobowe podane przy zakładaniu konta, rejestracji na eventy, zamawianiu prenumeraty, newslettera, alertów oraz usług online (w tym Strefy Premium, raportów, rankingów lub licencji na przedruki).

Administratorów tych danych osobowych, cele i podstawy przetwarzania oraz inne informacje wymagane przez RODO znajdziesz również w Polityce Prywatności pod tym linkiem. Dane zbierane na potrzeby różnych usług mogą być przetwarzane w różnych celach, na różnych podstawach oraz przez różnych administratorów danych.

Pamiętaj, że w związku z przetwarzaniem danych osobowych przysługuje Ci szereg gwarancji i praw, a przede wszystkim prawo do odwołania zgody oraz prawo sprzeciwu wobec przetwarzania Twoich danych. Prawa te będą przez nas bezwzględnie przestrzegane. Jeżeli więc nie zgadzasz się z naszą oceną niezbędności przetwarzania Twoich danych lub masz inne zastrzeżenia w tym zakresie, koniecznie zgłoś sprzeciw lub prześlij nam swoje zastrzeżenia pod adres odo@ptwp.pl. Wycofanie zgody nie wpływa na zgodność z prawem przetwarzania dokonanego przed jej wycofaniem.

W dowolnym czasie możesz określić warunki przechowywania i dostępu do plików cookies w ustawieniach przeglądarki internetowej.

Jeśli zgadzasz się na wykorzystanie technologii plików cookies wystarczy kliknąć poniższy przycisk „Przejdź do serwisu”.

Zarząd PTWP-ONLINE Sp. z o.o.

Logowanie

Dla subskrybentów naszych usług (Strefa Premium, newslettery) oraz uczestników konferencji ogranizowanych przez Grupę PTWP

Nie pamiętasz hasła?

Nie masz jeszcze konta? Kliknij i zarejestruj się teraz!